尺寸排阻色譜柱是一種廣泛應(yīng)用于生物分析領(lǐng)域的工具,其工作原理主要基于分子大小差異進(jìn)行分離。利用柱內(nèi)固定相中孔隙與分子間的物理作用來實(shí)現(xiàn)分離。具體來說,聚合物分子在柱子中的孔道中被篩選,較大的分子無法通過尺寸較小的孔道,只有較小的分子才能通過這些孔道,從而實(shí)現(xiàn)不同分子尺寸的分離。其優(yōu)點(diǎn)在于其分離速度快、操作簡單、分離效果好。此外,該技術(shù)不依賴于分子之間的親和性或化學(xué)性質(zhì),因此適用于各種生物大分子,如蛋白質(zhì)、多肽和核酸等的分離。
1、樣品制備:
清潔與溶解:確保樣品的清潔度,避免雜質(zhì)干擾分析結(jié)果。將樣品溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲?,使其形成均勻的溶液?/div>
過濾:為了去除可能存在的微小顆?;螂s質(zhì),需要對樣品溶液進(jìn)行過濾,以防止堵塞色譜柱。
定量:準(zhǔn)確測量樣品的體積和濃度,以便在后續(xù)分析中進(jìn)行準(zhǔn)確的計(jì)算和比較。
2、柱裝載:
填充劑選擇:根據(jù)待分離物質(zhì)的分子大小和性質(zhì),選擇合適的填充劑。填充劑通常由具有不同孔徑大小的多孔球形顆粒組成,如硅膠、聚合物等。
裝載方式:將填充劑均勻地裝入色譜柱中,確保填充劑的緊密性和均勻性,避免出現(xiàn)空隙或不均勻的情況。
溶液平衡:在裝載填充劑后,使用適當(dāng)?shù)木彌_液對色譜柱進(jìn)行平衡,以使填充劑充分潤濕并達(dá)到穩(wěn)定的工作狀態(tài)。
3、運(yùn)行參數(shù)設(shè)置:
流速控制:根據(jù)樣品的性質(zhì)和色譜柱的要求,設(shè)置合適的流速。流速過快可能導(dǎo)致分離效果不佳,流速過慢則會增加分析時(shí)間。
緩沖液濃度和pH值調(diào)節(jié):流動相緩沖液的濃度和pH值對分離效果有重要影響。一般來說,緩沖液的pH應(yīng)為7左右,并適度調(diào)整鹽濃度。對于疏水蛋白,可加入一定量的有機(jī)溶劑;對于易于離子化的蛋白,則需要提高緩沖鹽濃度。
4、檢測方法選擇:
紫外檢測:是常用的檢測方法之一,通過檢測樣品在特定波長下的吸光度來確定其濃度。蛋白檢測最常見的紫外波長是280nm,吸收值主要取決于酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)的含量。
蒸發(fā)光散射檢測:適用于沒有紫外吸收或紫外吸收較弱的物質(zhì),通過檢測樣品溶液在加熱后產(chǎn)生的蒸汽散射光強(qiáng)度來測定其濃度。
粘度檢測:可以提供關(guān)于大分子結(jié)構(gòu)、構(gòu)象、聚集以及支化等方面的信息,但通常需要與其他檢測技術(shù)結(jié)合使用。
5、數(shù)據(jù)處理:
峰面積計(jì)算:根據(jù)檢測器輸出的信號峰面積,計(jì)算樣品中各個(gè)組分的含量。
分子量測定:通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,將未知樣品的洗脫時(shí)間與已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較,從而測定未知樣品的分子量。
6、清洗與保存:
清洗:多次使用后某些樣品可能會吸附到入口篩板或填料上,當(dāng)積累到一定程度時(shí)會出現(xiàn)壓力升高并伴隨峰型展寬的現(xiàn)象,此時(shí)需要清洗色譜柱。一般流程為斷開檢測器,反接色譜柱,在低于50%較大推薦流速下用清洗液沖洗10-15倍柱體積。
保存:日常使用中,建議將色譜柱保存在150mM磷酸鹽緩沖液中(pH7.0)。如長期不用時(shí),可將色譜柱保存至20%乙醇中,以防止菌體污染。